摘要：目的研究银杏内酯滴丸中的主要成分银杏内酯A、B在健康受试者体内的药动学特征，为制定合理的临床给药方案提供依据。方法采用随机、开放的试验设计，10例健康受试者单次口服银杏内酯滴丸后，按预定时间点采集血样，肝素锂抗凝，离心分离血浆。采用LC-MS/MS法测定血浆样品中银杏内酯A、B的开闭环总质量浓度，以及银杏内酯A、B闭环质量浓度，并应用WinNonlin6.3软件非房室模型计算药动学参数。结果健康受试者单次口服银杏内酯滴丸后，银杏内酯A闭环及开闭环总量的tmax分别为（3.05±1.40）、（3.40±1.22）h，Cmax分别为（84.3±32.8）、（92.2±35.0）ng/mL，Cmax比值为91.4%，AUC0～t分别为（±）、（±）ng?h/mL，AUC0～t比值为84.5%，t1/2分别为（13.00±10.30）、（12.90±8.49）h；银杏内酯B闭环及开闭环总量的tmax分别为（3.15±1.42）、（3.35±1.25）h，Cmax分别为（74.10±31.50）、（.00±60.10）ng/mL，Cmax比值为50.1%，AUC0～t分别为（±）、（±）ng?h/mL，AUC0～t比值为44.5%，t1/2分别为（13.20±5.83）、（13.7±5.83）h。结论健康受试者口服银杏内酯滴丸后，银杏内酯A、B吸收速率适中，消除速率适中，在人血浆中银杏内酯A主要以闭环形式存在，而银杏内酯B以开、闭环2种形式存在、暴露量相当。
银杏内酯是从银杏叶及根中分离提取的萜内酯类化合物[1]，自20世纪60年代以来，许多研究者先后对银杏叶提取物的药理作用进行深入研究[2]，发现银杏内酯具有拮抗血小板活化因子（PAF）的作用，进一步的研究发现银杏内酯中的银杏内酯A、B、C、K等是主要发挥拮抗PAF受体作用的活性成分，其中银杏内酯B的拮抗作用最强。PAF是由内毒素和细胞因子诱导产生的具有多种功能的内源性磷脂介质，具有活化血小板的作用，对心功能、心电生理、动脉粥样硬化、心脏缺血及缺血再灌注损伤等多种生理病理过程产生影响[3-5]。银杏内酯通过特异性抑制PAF引起的多种病理过程从而保护脑缺血组织[6]。同时银杏内酯也是非特异性甘氨酸受体和γ-氨基丁酸受体拮抗剂[7-9]，银杏内酯通过拮抗以上2种受体从而加强对脑卒中后中枢神经的保护作用。此外，银杏内酯具有抗炎、抗氧化、抗抑郁、提高记忆力等作用。
银杏内酯（银杏内酯A、B闭环结构见图1）是由6个五元环形成的刚性笼状骨架结构[10]，其中包括1个螺[4,4]壬烷、1个四氢呋喃环和3个五元内酯环。内酯环结构的稳定性与溶剂的pH值密切相关，当在碱性介质中，内酯环易水解开环[11]。通过滴定法对介质中的pH值测定发现[12]，当pH值为7时内酯环开始开环；当pH值为8时，50%的F环开环，20%的E环开环；当pH值为10时，90%的E、F环开环，当pH值增至13时，40%的C环开环，E、F环全部开环，而开环后加入酸，可以使开环后的化合物转化成闭环的原化合物。天然产物化学研究表明无C环结构会使银杏内酯类似物活性大大降低，F环对活性没有影响。银杏内酯A、B吸收进入体内后，其内酯环结构在体内会发生闭环与开环的转化，处于动态变化状态。为了准确反映银杏内酯A、B药动学特性，有必要对主要发挥药效作用的闭环形式和部分发挥药效的开环形式进行药动学特征考察。由于只能获得闭环形式的对照品，本研究在开、闭环总浓度测定时通过酸化的方式使开环状态转化为闭环状态进行检测[13]。
20世纪70年代起，以银杏叶提取物为原料制成的制剂以及银杏内酯类制剂治疗心脑血管系统疾病具有疗效好、副作用小等特点[14]。国内外关于银杏内酯A、B的药动学研究大部分都局限于动物体内[15-17]，而人体药动学研究较少[13,18]，Li等[13]曾研究静脉滴注银杏二萜内酯葡胺注射液后银杏内酯A、B的内酯环在人血浆中水解后的暴露量。本研究建立了LC-MS/MS分析方法对银杏内酯A、B的开闭环总浓度和闭环浓度进行测定，并应用于10例健康受试者口服银杏内酯滴丸后银杏内酯A、B闭环及开闭环的血浆药物浓度测定和药动学研究，为该滴丸制剂的临床应用提供参考。
1材料
1.1药品与试剂
银杏内酯滴丸（规格为35mg/丸，含银杏内酯A、B分别为2.9、5.6mg/丸，批号为），江苏康缘药业股份有限公司；银杏内酯A对照品（质量分数97.4%，批号-）、银杏内酯B对照品（质量分数95.6%，批号-）、内标（IS）白果内酯对照品（质量分数99.8%，批号-）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯（美国Fisher公司）；醋酸乙酯为色谱纯（天津市康科德科技有限公司）；甲酸铵为分析纯、甲酸为色谱纯（天津市光复科技发展有限公司）；浓盐酸为分析纯（天津市凯信化学工业有限公司），超纯水为实验室自制。
1.2仪器
高效液相色谱系统（含LC-20AD二元梯度泵、SIL-20AC自动进样器、CTO-20A柱温箱、DGU-20A3脱气机，日本岛津公司）；QTRAP型四级杆-线性离子阱串联质谱（含TurboESI源、Analyst1.5.2工作站，美国ABSciex公司）；17R台式高速冷冻离心机，美国ThermoScientific公司；TurboVapLV型样品浓缩仪，美国Caliper公司。
2方法
2.1临床试验方案
临床试验在天津中医院开展，临床试验方案的制定、伦理委员会审核及临床医院进行。10名18～45岁健康受试者，男女各半，禁食10h以上，受试者口服5丸银杏内酯滴丸，mL水送服，整丸吞服。口服给药前（0h）和给药后0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、12、16、24、36、48h，共17个采血点，每次采集4mL全血，肝素锂抗凝，4℃、r/min离心10min，分离血浆。血浆由专业冷链物流公司冷链运输至本实验室，全程实时温度记录，保存于?70℃冰箱至检测分析。
2.2生物样品定量分析
2.2.1待测物确定银杏内酯滴丸制剂的含量标准为银杏内酯A、B，而且银杏内酯A、B为主要的药理活性成分，因此，选择对银杏内酯A、B进行定量检测分析。银杏内酯A、B的对照品为闭环形式，但给药后银杏内酯A、B的内酯环在体内会发生闭环与开环的转化，处于动态变化状态。为了准确反映银杏内酯主要成分药动学特征，分别建立了LC-MS/MS方法同时测定人血浆样品中银杏内酯A、B的开闭环总量（人血浆样品进行酸化后使开环物全部转化为闭环物），和LC-MS/MS方法同时测定人血浆样品中银杏内酯A、B闭环质量浓度的分析方法，并计算相应的药动学参数。
2.2.2LC-MS/MS分析条件
（1）液相条件：色谱柱WatersAtlantisT3（mm×4.6mm，5μm）；柱温40℃；流动相A为乙腈-甲醇（75∶25），B为0.5mmol/L甲酸铵-5%乙腈水溶液；体积流量0.5mL/min；梯度洗脱：0～3.5min，50%A；3.5～5.5min，50%～80%A；5.5～6.0min，80%A；6.1～8.0min，80%～50%A；自动进样器温度4℃；进样体积10μL。
（2）质谱条件：ESI离子源，负离子模式；喷雾电压为?V；源温度℃；GS1、GS2均为.kPa（50psi）；卷帘气为.kPa（15psi）；出口及入口电压均为?10V；碰撞气为55.kPa（8psi）；扫描模式为多反应监测（MRM）；银杏内酯A、B及白果内酯用于定量的离子对分别为m/z.1→.1、.2→.2、.1→.1，碰撞能均为?24V；去簇电压分别为?30、?40、?40V。
2.2.3血浆样品处理方法
（1）银杏内酯A、B的开闭环总量测定：μL人血浆样品（std-0、Blank为μL空白人血浆，随行曲线质控为含药血浆、未知人血浆样品）中加入50μL内标白果内酯甲醇溶液（Blank加入50μL甲醇），50μL2mol/LHCl，涡旋5min，室温放置40min，加入1mL醋酸乙酯，向玻璃试管中加入μL复溶液（甲醇-水-甲酸50∶50∶0.1），涡旋1min复溶，取复溶液于内插管中，4℃10r/min离心10min，进样10μL，进行LC-MS/MS定量分析。
（2）银杏内酯A、B闭环质量浓度测定：μL人血浆样品（std-0、Blank、随行曲线质控为空白人血浆、未知人血浆样品）中加入50μL内标白果内酯甲醇溶液（Blank加入50μL甲醇），50μL甲醇溶液（随行曲线质控加入50μL系列标准或质控工作液），以及1mL醋酸乙酯，涡旋2min，4℃、10r/min离心5min，取上层有机相μL至玻璃试管中，40℃氮气吹干。向玻璃试管中加入μL复溶液（甲醇-水-甲酸50∶50∶0.1），涡旋1min复溶，取复溶液于内插管中，4℃、10r/min离心10min，进样10μL，进行LC-MS/MS定量分析。
2.2.4LC-MS/MS分析方法验证2项LC-MS/MS定量分析方法均经过完整的方法学验证，考察内容包括系统适应性、特异性、残留、内标与待测物之间相互干扰、线性、灵敏度、日内与日间准确度、日内与日间精密度、基质效应、回收率、稳定性、稀释效应等。将银杏内酯A、B的闭环质量浓度及开闭环总量测定的方法学验证一并描述。
（1）系统适应性：吸取双样本系统适应性溶液样品，每份溶液连续进样3针，计算6个待测物与内标峰面积比值，并计算RSD值。6针系统适应性样品中待测物保留时间的RSD在0～0.%，内标保留时间的RSD在0～0.%，待测物与内标进样峰面积比的RSD在1.11%～2.37%，说明本方法的系统适应性良好。
（2）特异性：6个不同个体的人空白血浆μL，按“血浆样品处理方法”项下Blank处理方式处理。结果表明待测物银杏内酯A、B及内标白果内酯的保留时间分别为4.36、4.39、3.78min，代表性色谱图见图2。人空白血浆银杏内酯A、B的干扰在0.16%～2.68%，白果内酯的干扰在0.01%～0.28%，表明人血浆中的内源性物质不干扰待测物及内标的定量分析。
（3）残留：为考察进样残留情况，曲线最高质量浓度进样之后，分析空白人血浆样品。结果校正曲线最高质量浓度进样之后，人空白血浆样品中银杏内酯A、B的残留为0.24%～3.11%，内标白果内酯残留为0.%～0.%，表明待测物及内标的检测无残留影响。
（4）内标与待测物之间相互干扰：为考察内标与待测物相互干扰情况，制备只含有内标、不含有待测物的样品control-0样品，以及只含有待测物（校正曲线最高质量浓度）、不含有内标的ULOQ-noIS样品，进行LC-MS/MS分析。control-0样品中待测物的峰面积干扰为0.%～2.%，ULOQ-noIS样品中内标的峰面积干扰为0.%～0.%，表明内标与待测物之间不存在交叉影响。
（5）线性关系考察：配制并处理7个质量浓度水平的校正对照品样品，按“血浆样品处理方法”项下随行曲线处理方式处理，考察3个分析批次，每批每个质量浓度校正对照品样品双样本。人血浆中银杏内酯A、B的开闭环总量和闭环质量浓度线性范围均为0.5～ng/mL。银杏内酯A总量测定校正曲线：Y＝0.X＋0.（r＝0.），银杏内酯B总质量浓度测定校正曲线：Y＝0.X＋0.（r＝0.）。
（6）灵敏度：配制并处理定量下限（LLOQ）水平的质控样品，按“血浆样品处理方法”项下质控样品处理方式处理，考察3个分析批次，每批6个样本。LLOQ：在0.5ng/mL质量浓度下，银杏内酯A、B的批内、批间准确度在88.3%～98.5%，批内、批间精密度在2.06%～10.50%，表明本方法测定人血浆中的银杏内酯A、B的LLOQ可以达到0.5ng/mL。
（7）准确度与精密度：配制并处理低、中、高质量浓度水平的质控样品，按“血浆样品处理方法”项下质控样品处理方式处理，考察3个分析批次，每批每个质量浓度6个样本。银杏内酯A、B在1.25、12.5、75ng/mL水平的批内、批间准确度在93.8%～%，批内、批间精密度在0.68%～12.10%，均符合测定要求。
（8）基质效应与回收率：分别取μL银杏内酯A/B质量浓度为25/25、/、/ng/mL甲醇溶液，加入μL内标工作液及μL0.2%的甲酸水溶液混匀制备总量方法学验证溶液；分别取μL银杏内酯A/B质量浓度为5/5、50/50、/ng/mL甲醇溶液，加入μL内标工作液及μL0.2%的甲酸水溶液混匀制备闭环质量浓度方法学验证溶液。基质效应样品按各自空白样品处理方式吹干，再使用各自的验证溶液复溶。基质效应样品测得的峰面积与相应质量浓度的验证样品测得的峰面积比值，即待测物和内标的基质因子；进一步通过计算待测物的基质因子与内标的基质因子之比，获得内标归一化的基质效应因子。配制并处理低、中、高质量浓度水平的质控样品，质控样品测得的峰面积与相应质量浓度的基质效应样品测得的峰面积比值为回收率。结果银杏内酯A内标归一化基质因子为0.92～1.08，RSD在0.88%～8.08%；银杏内酯B内标归一化基质因子在0.93～1.26，RSD在1.15%～14.90%。银杏内酯A的回收率在87.70%～93.10%，RSD在1.00%～3.86%；银杏内酯B的回收率在78.70%～99.60%，RSD在1.00%～3.92%；内标白果内酯的回收率在85.90%～95.20%，RSD在2.39%～4.03%。
（9）稳定性：含药血浆在不同条件下放置并按照未知样本的血浆样本处理方式处理，考察银杏内酯A、B（开闭环总质量浓度）血浆样品室温放置4h、?70℃至室温冻融3次、?20℃冻存9d、?70℃冻存80d处理后样品于进样器温度下（4℃）放置58h后的稳定性。考察银杏内酯A、B（闭环质量浓度）冰上放置1h后、?70℃至冰上冻融1次、?20℃冻存9d；?70℃冻存79d处理后样品于进样器温度下（4℃）放置27h的稳定性。结果银杏内酯A、B（开闭环总量）血浆样品室温放置4h稳定（准确度在95.10%～.00%），?70℃至室温冻融3次稳定（准确度在93.50%～97.50%）；?20℃冻存9d稳定（准确度在93.20%～99.20%）；?70℃冻存80d稳定（准确度在92.10%～99.30%）。处理后样品于进样器温度下（4℃）放置58h后稳定（准确度在95.30%～.00%）。银杏内酯A、B（闭环质量浓度）冰上放置1h后稳定（准确度在89.80%～97.30%）；?70℃至冰上冻融1次稳定（准确度在98.60%～.00%）；?20℃冻存9d稳定（准确度在91.40%～.00%）；?70℃冻存79d稳定（准确度在94.70%～.00%）。处理后样品于进样器温度下（4℃）放置27h后稳定（准确度在94.70%～.00%）。
（10）稀释效应：取银杏内酯A/B质控混合储备液II（10/10μg/mL，取质量浓度为50/50μg/mL混合储备液I2mL于玻璃瓶中，加8mL甲醇稀释混匀）10μL，加入μL空白人血浆涡旋混匀，配制成质量浓度为/ng/mL的DQC样品，取20μL/ng/mL的DQC含药血浆，加入μL空白人血浆稀释10倍，制备稀释10倍的稀释质控样品（开闭环总量测定稀释效应）。为避免采用空白人血浆直接稀释含药人血浆样本引起开闭环的转化，采用将血浆样品处理完后用处理后的std-0样品进行稀释分析的方式。μL空白人血浆加入50μL/ng/mL质控工作液，按“血浆样品处理方法”项下质控样品处理方式处理，取25μL处理后的稀释质控上清液，加入50μL处理后的std-0上清液，涡旋混合，制备稀释3倍的稀释质控样品。开闭环总质量浓度测定时，用空白血浆稀释4倍的稀释质控样品，银杏内酯A、B准确度分别为95.80%、96.30%，RSD分别为4.45%、4.72%，表明对人血浆样品进行稀释后分析，结果能够准确反映超出曲线范围的银杏内酯A、B的开闭环总质量浓度；闭环质量浓度测定时，稀释质控样品处理完后用处理后的std-0样品稀释3倍，银杏内酯A、B准确度分别为98.00%、97.30%，RSD分别为2.98%、3.21%，表明人血浆样品处理完后用处理后的std-0样品进行稀释后分析，结果能够准确反映超出曲线范围的银杏内酯A、B闭环质量浓度。
2.3药动学参数的计算采用WinNonlin6.3软件非房室模型统计矩法计算各受试者体内银杏内酯A、B的开闭环总量的药动学参数，以及银杏内酯A、B闭环的药动学参数，包括Cmax、AUC0～t、AUC0～∞、tmax、t1/2、λz、Vd/F、CL/F。其中AUC0～t、AUC0～∞采用梯形法计算，t1/2采用BestFit法计算，Cmax、tmax采用实测值。
3结果
3.1健康受试者单次口服银杏内酯滴丸后银杏内酯A的药动学特征
3.1.1银杏内酯A的血药浓度健康受试者单次口服银杏内酯滴丸后，平均血浆药物质量浓度数据及药时曲线见表1和图3。结果显示，健康受试者单次口服银杏内酯滴丸后，银杏内酯A在人血浆中主要以闭环形式存在，各时刻闭环质量浓度占开闭环总质量浓度的80%以上，开环/闭环比例趋于平稳后，闭环暴露量维持在80%左右。银杏内酯A闭环与开闭环总质量浓度的变化趋势基本一致，反映吸收、分布、消除的各个曲线段基本平行，于给药后3h左右达峰，随后血药浓度逐渐下降，至服药后48h已下降到Cmax的1/10以下。
3.1.2银杏内酯A的药动学参数单次口服银杏内酯滴丸后，将每位受试者血浆中银杏内酯A的开闭环总质量浓度数据以及闭环质量浓度数据分别应用WinNonlin6.3软件，选择非房室模型统计矩法计算药动学参数，结果见表2。血浆中银杏内酯A闭环及开闭环的Cmax分别为（84.30±32.80）、（92.20±35.00）ng/mL，两者比值为91.40%，AUC0～t分别为（.00±.00）、（.00±.00）ng?h/mL，两者比值为84.50%，t1/2分别为（13.00±10.30）、（12.90±8.49）h。提示健康人口服银杏内酯滴丸后，银杏内酯A可以被吸收，吸收速率适中，且在人血浆中主要以闭环形式存在。
3.2健康受试者单次口服银杏内酯滴丸后银杏内酯B的药动学特征
3.2.1银杏内酯B的血药浓度健康人单次口服银杏内酯滴丸后，平均血浆药物质量浓度数据及药时曲线见表3和图4，结果显示口服银杏内酯滴丸后初始阶段，血浆中银杏内酯B主要以闭环形式为主，占60%左右，随后闭环逐渐向开环转化，开环/闭环比例趋于平稳后，闭环形式暴露量维持在45%左右。银杏内酯B闭环与开闭环总质量浓度的变化趋势基本一致，反映吸收、分布、消除的各个曲线段基本平行，于给药后3h左右达峰，随后血药浓度逐渐下降，至服药后48h已下降到Cmax的1/10以下。
3.2.2银杏内酯B的药动学参数单次口服银杏内酯滴丸后，将每位受试者血浆中银杏内酯B的开闭环总质量浓度数据以及闭环质量浓度数据分别应用WinNonlin6.3软件，选择非房室模型统计矩法计算药动学参数，结果见表4。血浆中银杏内酯B闭环及开闭环的Cmax分别为（74.10±31.50）、（.00±60.10）ng/mL，二者比值为50.1%，AUC0～t分别为（.00±.00）、（.00±.00）ng?h/mL，二者比值为44.5%，t1/2分别为（13.20±5.83）、（13.70±5.83）h。提示健康人口服银杏内酯滴丸后，银杏内酯B可以被吸收，吸收速率适中，且在血浆中以开、闭环2种形式存在，2种形式暴露量相当。
4讨论
银杏内酯滴丸中银杏内酯A、B的含量分别为2.9、5.6mg/丸，比例为1∶1.93。健康受试者单次口服银杏内酯滴丸后，血浆中银杏内酯A、B开闭环总量的AUC0～t分别为（±）、（±）h?ng/mL，暴露量比值为1∶1.87。银杏内酯A、B的暴露量（1∶1.87）与制剂中成分含量（1∶1.93）成比例。健康人口服银杏内酯滴丸后，由于银杏内酯A、B的结构及性质相似，机体对其吸收入血和从体内消除过程基本一致，因此两者的暴露量与制剂比例相近。文献报道[13]有关于银杏内酯A、B水解开环的相关药动学参数，3名健康男性静脉滴注银杏二萜内酯葡胺注射液后银杏内酯A、B的半衰期为9、11h，与本研究的银杏内酯A、B的总量及闭环的半衰期也基本一致。
滴丸制剂具有吸收迅速、生物利用度高的特点，药物高度分散到不同载体，属于多剂量给药形式。滴丸比表面积大，增大了药物与消化道接触面积，有利于药物的吸收。再加上口服滴丸给药后的Cmax低于注射给药的峰值，从而使滴丸口服给药后安全性在可控范围内，减少不良反应的发生。
参考文献（略）来源：周莹，谷元，张思瑶，高宇，张如月，尚海花，武丽南，司端运.银杏内酯滴丸在健康受试者体内的药动学研究[J].中草药,0,51(9):-.预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇